圖1：搖床內(nèi)部的設(shè)置：將搖瓶放置在杯

     在這項研究中，已經(jīng)建立了搖瓶規(guī)模的反饋控制縮小模型。使用集成在搖瓶中的化學(xué)光學(xué)傳感器（PSt3型）測量釀酒酵母培養(yǎng)物中的溶解氧（DO）濃度。溶解氧水平觸發(fā)了按需碳進料。這種設(shè)置允許在搖瓶中進行自動補料分批培養(yǎng)，并提高在此規(guī)模下獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量，而不會影響結(jié)果的數(shù)量。搖瓶培養(yǎng)中的不同菌株與生物反應(yīng)器規(guī)模表現(xiàn)出相同的排名。在第二個實驗中，在反饋控制系統(tǒng)中測試了DO-stat和碳限制過程。結(jié)果表明，采用該裝置，該過程可以在搖瓶規(guī)模下成功進行。

圖2：釀酒酵母在按需喂養(yǎng)搖瓶設(shè)置中的培養(yǎng)。

     圖3：四種釀酒酵母菌株在搖晃片尺度（藍色）和生物反應(yīng)器量表（紅色）下的比較：細胞干重（頂部），產(chǎn)物濃度（中）和相對生產(chǎn)參數(shù)Ypx（底部）。

圖4：DO-Stat：碳限制過程;DO設(shè)定值 20 %。

      在用于生產(chǎn)藥物、蛋白質(zhì)或營養(yǎng)添加劑的生物工藝開發(fā)中，在測試合適的細胞系、培養(yǎng)基組成和工藝條件時，使用縮小模型來節(jié)省時間和成本。然而，通常很難確定小規(guī)模工藝放大的關(guān)鍵參數(shù)。搖瓶通常用于生物技術(shù)研究和生產(chǎn)。它們代表了昂貴的大規(guī)模生物反應(yīng)器系統(tǒng)的低成本替代品，并且更容易處理。另一方面，沒有建立在線監(jiān)測和控制這種規(guī)模的重要培養(yǎng)參數(shù)的系統(tǒng)。需要一種可靠的自動進料方法和消除手動取樣，以改善搖瓶規(guī)模的生物工藝開發(fā)。在這些實驗中，測試了可用于搖瓶培養(yǎng)的反饋控制系統(tǒng)。培養(yǎng)物中的溶解氧含量觸發(fā)碳源飼料，PreSens使用化學(xué)光學(xué)傳感器技術(shù)在線測量。氧傳感器集成在玻璃錐形瓶的底部，并通過透明燒瓶壁非侵入性地讀取。傳感器信號被傳輸?shù)?OXY-10 mini，這是一款 10 通道氧計，可在多達 10 個搖瓶中同時在線測量。使用蠕動泵，根據(jù)需要自動將葡萄糖溶液添加到培養(yǎng)物中。在釀酒酵母培養(yǎng)物中按需使用脈沖飼料進行測試，并將結(jié)果與生物反應(yīng)器規(guī)模（20 L）獲得的值進行比較。此外，該系統(tǒng)還用于測試碳限制過程，用于提高生物質(zhì)和產(chǎn)品產(chǎn)量，其中DO試圖保持在20%左右。

材料與方法

      在 工作體積為100 mL的500 mL玻璃搖瓶中進行實驗，在2.5 cm投擲時搖晃速率為< 250 rpm，或在5.0 cm投擲時<200 rpm。每個燒瓶的底部都有一個氧傳感器點，并放置在Coaster CFG的頂部。杯墊是一種附件，可以將傳感器信號傳輸?shù)窖鯕庥?。OXY-10 mini通過RS232連接到Lantronix S2E轉(zhuǎn)換器，該轉(zhuǎn)換器連接到AdamBus A / D轉(zhuǎn)換器。AdamBus A/D-轉(zhuǎn)換器控制蠕動泵進行進料。一臺帶有Lucullus PIMS的PC用于從Lantronix S2E轉(zhuǎn)換器收集數(shù)據(jù)并監(jiān)控過程。每個搖瓶連接到帶有硅膠或藥用管（直徑12 - 16管）的單個蠕動泵，允許0 - 50 g / h的流量。將試管連接到搖瓶蓋上（見圖1）。實際進料速率是通過流量與泵速的相關(guān)性計算的。首先，在8個搖瓶中對四種不同的釀酒酵母菌株進行實驗，一式兩份。根據(jù)需要將500 g / L葡萄糖溶液作為碳源以0.5小時的脈沖以20 g / h的進料速率給予培養(yǎng)物。進給速率和脈沖時間是經(jīng)驗值。當(dāng)ΔDO/10分鐘>10%時觸發(fā)進料啟動。在第二個實驗中，釀酒酵母試圖在碳限制過程中保持在靜態(tài)DO。使用150 g/L葡萄糖溶液，當(dāng)ΔDO/10 min>10 %時再次觸發(fā)進料啟動。使用簡單的兩步控制器將溶解氧保持在20%的設(shè)定值，增量為0.5%。

結(jié)果

       按需饋送實驗運行96小時（見圖2）。在第一階段，初始葡萄糖被消耗，并且由于釀酒酵母的雙氧生長部分轉(zhuǎn)化為乙醇。細胞的生長導(dǎo)致溶解氧水平降低，并且在大約22小時（DO信號中的小峰）葡萄糖耗盡并且乙醇繼續(xù)生長。由于搖瓶的氧氣轉(zhuǎn)移能力有限，DO水平在40小時左右達到零。當(dāng)乙醇也耗盡時，培養(yǎng)基中不存在其他碳源，導(dǎo)致細胞對氧的吸收減少，因此溶解氧水平升高。這種增加被用作葡萄糖添加的觸發(fā)因素。一旦再次消耗添加的葡萄糖和產(chǎn)生的乙醇，就開始下一個添加物。將搖瓶設(shè)置中四種釀酒酵母菌株的干重和產(chǎn)量與在生物反應(yīng)器規(guī)模（20 L）下相同菌株獲得的結(jié)果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)物的細胞干重和產(chǎn)物濃度達到較低的輸出（圖3），這是由生物反應(yīng)器的較高氧轉(zhuǎn)移容量引起的。然而，所有菌株在兩個栽培規(guī)模上都表現(xiàn)出相同的排名，這使得能夠挑選具有特殊特征的菌株用于以后的放大過程。相對生產(chǎn)參數(shù)的比較顯示，搖瓶培養(yǎng)值與生物反應(yīng)器規(guī)模的培養(yǎng)值具有良好的一致性（圖3）。在第二個實驗中，自動搖瓶系統(tǒng)在具有靜態(tài)DO的碳限制培養(yǎng)中進行了測試。 圖4顯示自動飼喂系統(tǒng)可用于進行DO-Stat培養(yǎng)。當(dāng)溶解氧水平低于設(shè)定值時，進給速率降低，反之亦然。所選參數(shù)（0.5%進給速率增量，1小時步進時間）已經(jīng)產(chǎn)生了非常好的溶氧控制。使用定義的工藝條件進行進一步微調(diào)可以降低溶解氧信號的振蕩。

結(jié)論

     開發(fā)的用于搖瓶培養(yǎng)的按需飼喂系統(tǒng)顯示出良好的效果，與生物反應(yīng)器規(guī)模的值進行比較，可以得出結(jié)論，可以在此規(guī)模下比較和挑選不同的菌株。此外，在此設(shè)置中進行的測試非常節(jié)省時間。在生物反應(yīng)器規(guī)模下只能運行 2 或 3 個實驗的情況下，該系統(tǒng)允許每周進行 8 - 10 次測試。即使在碳限制過程中，系統(tǒng)也取得了意想不到的良好結(jié)果。在縮小比例過程中進行實驗時，能夠與PreSens OXY-10 mini同時在線和在多個搖瓶中測量溶解氧是一個重要優(yōu)勢。SFR 搖瓶讀數(shù)儀允許在多達 9 個搖瓶中測量氧氣和 pH 值，進一步實驗可能會增強這種自動化且部分可控的搖瓶秤系統(tǒng)。已經(jīng)計劃進一步開發(fā)設(shè)置