杯墊CFG上方的搖瓶用于讀取光學(xué)傳感器

     研究了不同栽培條件下谷棒狀桿菌和兩種不同白喉棒狀桿菌培養(yǎng)物中缺氧的影響。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以表征低氧濃度對氮代謝的特定酶 - 銨轉(zhuǎn)移酶谷氨酸脫氫酶（GDH）的影響。Oxgyen監(jiān)測使用PreSens的氧氣儀Fibox 3進(jìn)行。所有測試的棒狀桿菌培養(yǎng)物的生長速率取決于氧氣供應(yīng)，并且可用的氧氣越多，生長速率就越高。所研究的GDH活性似乎不受谷氨酸C.低氧水平的影響。在白喉衣原體培養(yǎng)物中，GDH活性在某些條件下增加，但只能確定非常低的活性值，這可能不顯著。

     銨的同化，被稱為谷氨酸C.的氮源，主要通過NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶（GDH）完成。該酶將銨轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸，這使得GDH成為一種生物技術(shù)上重要的酶，因?yàn)槭称饭I(yè)需要大量谷氨酸作為增味劑。因此，一個(gè)目標(biāo)是提高GDH的效率。在谷氨酸梭菌和白喉梭菌等需氧細(xì)菌中，氧限制會(huì)影響新陳代謝，也可能損害GDH活性。在T. Müller[2]先前的研究中，可以觀察到在氧氣排除下谷氨酸C. gdh的轉(zhuǎn)錄減少。以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了缺氧對谷氨酸衣原體和白喉梭菌培養(yǎng)物生長速率、GDH活性和GDH轉(zhuǎn)錄的影響。測試具有不同培養(yǎng)體積和振蕩速度的不同培養(yǎng)條件。Fibox 3與化學(xué)光學(xué)氧傳感器一起用于在整個(gè)培養(yǎng)期間培養(yǎng)物中的非侵入性氧監(jiān)測。

材料與方法

    實(shí)驗(yàn)使用300 mL擋板玻璃搖瓶，其中一些在內(nèi)底壁上附有氧傳感器點(diǎn)（PreSens）。杯墊CFG是一個(gè)適配器，放置在傳感器點(diǎn)正對面的搖瓶下方，并通過PreSens連接到氧氣計(jì)Fibox 3以讀取傳感器響應(yīng)。在整個(gè)培養(yǎng)過程中以30秒的采樣率監(jiān)測和記錄氧氣濃度。本研究使用了谷氨酸梭菌ATCC13032野生型菌株和兩種白喉梭菌野生型菌株DSM44123和DSM43988[1]。為了檢查不同培養(yǎng)條件下的耗氧差異，在125 rpm的振蕩速度下，體積為25 mL、50 mL和100 mL，并在100 rpm和150 rpm的振蕩速度下測試了另外兩種50 mL體積的培養(yǎng)物。對于每一系列測試，在搖瓶中接種四個(gè)平行培養(yǎng)物。在每個(gè)系列中，取三個(gè)15mL樣品，每個(gè)樣品來自單獨(dú)的培養(yǎng)容器，用于谷氨酸脫氫酶活性測量和RNA雜交：0.5小時(shí)，2.5小時(shí)和6.5小時(shí)后。剩余的搖瓶裝有用于氧氣監(jiān)測的傳感器點(diǎn)。gdh DNA片段通過集落PCR擴(kuò)增，隨后通過凝膠電泳純化，并用NucleoSpin®提取物試劑盒（Macherey-Nagel，Düren）提取。GDH活性按照T. Müller[2]的描述進(jìn)行測量，并用以下公式計(jì)算：

活動(dòng) = （ΔA x V） / （ε x t x m x d）

     Delta A是吸光度降低，V是總反應(yīng)體積。Epsilon是消光系數(shù)，t是反應(yīng)時(shí)間，m蛋白在反應(yīng)混合物中（mg）和d層厚度。用Roti-Quant®在oD下測量反應(yīng)混合物中的蛋白質(zhì)595.使用NucleoSpin® RNA II-Kit （Macherey-Nagel， Düren）進(jìn)行總RNA的分離。標(biāo)記的RNA探針的合成和RNA雜交按照E. H?nssler的描述進(jìn)行[3]。

圖1：不同體積（A）和不同振蕩速度（B）的谷氨酸梭菌培養(yǎng)物的氧濃度和oD。

圖2：谷氨酸梭菌培養(yǎng)物中的氧濃度和GDH活性（A）;白喉衣原體DSM44123和DSM43988培養(yǎng)物中GDH活性的比較（B）。

氧氣消耗和增長率

       將培養(yǎng)0.5、2.5和6.5小時(shí)的氧氣水平與當(dāng)時(shí)的光密度進(jìn)行比較（圖1）?？梢杂^察到，谷氨酸衣原體和白喉衣原體的生長速率取決于氧氣供應(yīng)。不同的條件，如不同的振蕩速度和培養(yǎng)量，導(dǎo)致氧氣供應(yīng)的變化?？傊?，可用的氧氣越多，生長速度就越高，與已知的數(shù)據(jù)相匹配。在培養(yǎng)快速生長的細(xì)菌（如谷氨酸梭菌）時(shí)，監(jiān)測生長速率和氧氣濃度的相關(guān)性非常重要。因?yàn)?，例如，與以125 rpm搖動(dòng)的培養(yǎng)物相比，用150 rpm搖動(dòng)的谷氨酸C. glutamum培養(yǎng)物顯示出更低的氧氣水平，但OD更高，這可能導(dǎo)致氧氣隨著時(shí)間的推移而耗盡。像白喉梭菌這樣生長緩慢的細(xì)菌的耗氧量非常低，因此它幾乎與氧氣輸入保持平衡。在所有系列實(shí)驗(yàn)中，耗氧量都超過了氧氣輸入，濃度降低。沒有系列達(dá)到氧氣限制。

缺氧對GDH的影響

      比較谷氨酸C. glutamum的GDH活性和氧氣消耗沒有顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性（圖2A）;氧氣的減少導(dǎo)致GDH活性的強(qiáng)弱下降。此外，在氧氣減少與gdh轉(zhuǎn)錄本量之間沒有顯著相關(guān)性。GDH活性的降低在6.5小時(shí)內(nèi)為0.25-0.7U / mg。這些值非常低，可能是由波動(dòng)或其他調(diào)節(jié)過程的結(jié)果引起的。然而，不能排除氧氣消耗對GDH活性的影響。與谷氨酸衣原體相比，在某些培養(yǎng)條件下，在白喉梭菌的兩個(gè)菌株中都可以觀察到GDH活性略有增加（圖2B）。但是測量值真的很低，可能并不重要。兩種白喉菌株培養(yǎng)過程中氧濃度均或多或少降低，GDH活性均增加和降低。白喉衣原體DSM44123的斑點(diǎn)印跡顯示轉(zhuǎn)錄本增加（25mL / 125rpm除外），這與GDH活性測量無關(guān)。這可能表明谷氨酸脫氫酶在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)節(jié)。白喉梭菌DSM43988菌株中的斑點(diǎn)印跡和GDH活性測量或多或少匹配，但與白喉梭菌DSM 44123獲得的結(jié)果不匹配。由于兩種菌株的結(jié)果不同，無法得出關(guān)于缺氧對白喉衣原體GDH的影響的明確結(jié)論。

結(jié)論與觀點(diǎn)

       在測試的培養(yǎng)條件下，在谷氨酸衣原體和白喉衣原體的培養(yǎng)物中，氧濃度對GDH活性沒有一定的影響。由于只能測量非常低的GDH活性值，因此必須使用大量蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的測試。谷氨酸梭菌培養(yǎng)的結(jié)果并未證實(shí)在T. Müller研究中觀察到的預(yù)期影響[2]。其他條件可能必須進(jìn)行測試，例如以更低的搖晃速率或不搖晃進(jìn)行栽培。由于氧氣的減少有望降低GDH活性，因此相反的方法 - 額外的氧氣輸入 - 可以提供更詳細(xì)的見解。這些新方法可能會(huì)為GDH活性測量提供更好或更顯著的結(jié)果